A cromatografía líquida é o principal método para probar o contido de cada compoñente e impurezas en materias primas, produtos intermedios, preparados e materiais de envasado, pero moitas substancias non teñen métodos estándar para confiar, polo que é inevitable desenvolver novos métodos. No desenvolvemento de métodos de fase líquida, a columna cromatográfica é o núcleo da cromatografía líquida, polo que é fundamental escoller unha columna cromatográfica adecuada. Neste artigo, o autor explicará como elixir unha columna de cromatografía líquida a partir de tres aspectos: ideas xerais, consideracións e ámbito de aplicación.
A.Ideas xerais para seleccionar columnas de cromatografía líquida
1. Avaliar as propiedades físicas e químicas do analito: como estrutura química, solubilidade, estabilidade (como se é fácil de oxidar/reducir/hidrolizarse), acidez e alcalinidade, etc., especialmente a estrutura química é a clave. factor na determinación das propiedades, como o grupo conxugado ten unha forte absorción ultravioleta e forte fluorescencia;
2. Determine o propósito da análise: se é necesario unha alta separación, alta eficiencia da columna, curto tempo de análise, alta sensibilidade, resistencia a alta presión, longa vida útil da columna, baixo custo, etc.
- Escolla unha columna cromatográfica adecuada: comprende a composición, as propiedades físicas e químicas do recheo cromatográfico, como o tamaño de partícula, o tamaño dos poros, a tolerancia á temperatura, a tolerancia ao pH, a adsorción do analito, etc.
- Consideracións para a selección de columnas de cromatografía líquida
Neste capítulo analizaranse os factores a ter en conta á hora de seleccionar unha columna de cromatografía desde a perspectiva das propiedades físicas e químicas da propia columna de cromatografía. 2.1 Matriz de recheo
2.1.1 Matriz de xel de sílice A matriz de recheo da maioría das columnas de cromatografía líquida é o xel de sílice. Este tipo de recheo ten alta pureza, baixo custo, alta resistencia mecánica e é fácil de modificar grupos (como enlace fenilo, enlace amino, enlace ciano, etc.), pero o valor de pH e o intervalo de temperatura que tolera son limitados: o O intervalo de pH da maioría dos recheos de matriz de xel de sílice é de 2 a 8, pero o intervalo de pH das fases unidas de xel de sílice especialmente modificadas pode ser tan amplo como de 1,5 a 10, e tamén hai fases unidas de xel de sílice especialmente modificadas que son estables a pH baixo. como Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, que é estable a pH de 1 a 8; o límite superior de temperatura da matriz de xel de sílice adoita ser de 60 ℃, e algunhas columnas de cromatografía poden tolerar unha temperatura de 40 ℃ a pH alto.
2.1.2 Matriz de polímero Os recheos de polímero son principalmente poliestireno-divinilbenceno ou polimetacrilato. As súas vantaxes son que poden tolerar un amplo intervalo de pH: poden usarse no intervalo de 1 a 14 e son máis resistentes ás altas temperaturas (poden alcanzar os 80 °C). En comparación cos recheos C18 a base de sílice, este tipo de recheo ten unha hidrofobicidade máis forte e o polímero macroporoso é moi eficaz para separar mostras como proteínas. As súas desvantaxes son que a eficiencia da columna é menor e a resistencia mecánica é máis débil que a dos recheos a base de sílice. 2.2 Forma das partículas
A maioría dos recheos de HPLC modernos son partículas esféricas, pero ás veces son partículas irregulares. As partículas esféricas poden proporcionar menor presión de columna, maior eficiencia da columna, estabilidade e maior vida útil; cando se usan fases móbiles de alta viscosidade (como o ácido fosfórico) ou cando a solución da mostra é viscosa, as partículas irregulares teñen unha superficie específica maior, o que favorece a acción total das dúas fases e o prezo é relativamente baixo. 2.3 Tamaño das partículas
Canto menor sexa o tamaño das partículas, maior será a eficiencia da columna e maior será a separación, pero peor será a resistencia á alta presión. A columna máis utilizada é a columna de tamaño de partícula de 5 μm; se o requisito de separación é alto, pódese seleccionar un recheo de 1,5-3 μm, o que é propicio para resolver o problema de separación dalgunhas mostras de matrices complexas e de varios compoñentes. UPLC pode usar recheos de 1,5 μm; Os recheos de partículas de 10 μm ou máis adoitan usarse para columnas semipreparativas ou preparativas. 2.4 Contido de carbono
O contido de carbono refírese á proporción de fase unida na superficie do xel de sílice, que está relacionada coa superficie específica e a cobertura da fase unida. O alto contido de carbono proporciona unha alta capacidade de columna e alta resolución, e úsase a miúdo para mostras complexas que requiren alta separación, pero debido ao longo tempo de interacción entre as dúas fases, o tempo de análise é longo; As columnas cromatográficas de baixo contido en carbono teñen un tempo de análise máis curto e poden mostrar diferentes selectividades, e adoitan usarse para mostras simples que requiren análise rápida e mostras que requiren condicións de fase acuosa elevadas. Xeralmente, o contido de carbono do C18 oscila entre o 7% e o 19%. 2.5 Tamaño de poro e superficie específica
Os medios de adsorción por HPLC son partículas porosas e a maioría das interaccións teñen lugar nos poros. Polo tanto, as moléculas deben entrar nos poros para ser adsorbidas e separadas.
O tamaño dos poros e a superficie específica son dous conceptos complementarios. O pequeno tamaño de poro significa unha gran superficie específica, e viceversa. Unha gran superficie específica pode aumentar a interacción entre as moléculas da mostra e as fases unidas, mellorar a retención, aumentar a carga da mostra e a capacidade da columna e a separación de compoñentes complexos. Os recheos totalmente porosos pertencen a este tipo de recheos. Para aqueles con altos requisitos de separación, recoméndase escoller recheos con gran superficie específica; A pequena superficie específica pode reducir a contrapresión, mellorar a eficiencia da columna e reducir o tempo de equilibrio, o que é axeitado para a análise de gradientes. Os recheos de núcleo-shell pertencen a este tipo de recheos. Partindo da premisa de garantir a separación, recoméndase elixir recheos con pequena superficie específica para aqueles con altos requisitos de eficiencia de análise. 2.6 Volume de poros e resistencia mecánica
O volume de poros, tamén coñecido como "volume de poros", refírese ao tamaño do volume baleiro por unidade de partícula. Pode reflectir ben a resistencia mecánica do recheo. A resistencia mecánica dos recheos con gran volume de poros é lixeiramente máis débil que a dos recheos con pequeno volume de poros. Os recheos con volume de poros inferior ou igual a 1,5 mL/g úsanse principalmente para a separación por HPLC, mentres que os recheos con volume de poros superior a 1,5 mL/g úsanse principalmente para a cromatografía de exclusión molecular e a cromatografía de baixa presión. 2.7 Taxa de límite
A limitación pode reducir os picos de caudal causados pola interacción entre compostos e grupos silanol expostos (como enlaces iónicos entre compostos alcalinos e grupos silanol, forzas de van der Waals e enlaces de hidróxeno entre compostos ácidos e grupos silanol), mellorando así a eficiencia da columna e a forma do pico. . As fases unidas sen tapa producirán diferentes selectividades en relación ás fases unidas tapadas, especialmente para mostras polares.
- Ámbito de aplicación de diferentes columnas de cromatografía líquida
Neste capítulo describirase o ámbito de aplicación dos diferentes tipos de columnas de cromatografía líquida a través dalgúns casos.
3.1 Columna cromatográfica C18 de fase inversa
A columna C18 é a columna de fase inversa máis utilizada, que pode cumprir as probas de contido e impurezas da maioría das substancias orgánicas, e é aplicable a substancias polares medios, débilmente polares e non polares. O tipo e especificación da columna cromatográfica C18 deben seleccionarse segundo os requisitos específicos de separación. Por exemplo, para substancias con altos requisitos de separación, úsanse a miúdo especificacións de 5 μm * 4,6 mm * 250 mm; para substancias con matrices de separación complexas e polaridade similar, pódense utilizar especificacións de 4 μm*4,6 mm*250 mm ou partículas de tamaños máis pequenos. Por exemplo, o autor utilizou unha columna de 3 μm*4,6 mm*250 mm para detectar dúas impurezas xenotóxicas no API de celecoxib. A separación das dúas substancias pode chegar a 2,9, o que é excelente. Ademais, baixo a premisa de garantir a separación, se é necesaria unha análise rápida, adoita seleccionarse unha columna curta de 10 mm ou 15 mm. Por exemplo, cando o autor utilizou LC-MS/MS para detectar unha impureza xenotóxica no API de fosfato de piperaquina, utilizouse unha columna de 3 μm * 2,1 mm * 100 mm. A separación entre a impureza e o compoñente principal foi de 2,0 e a detección dunha mostra pódese completar en 5 minutos. 3.2 Columna de fenilo de fase inversa
A columna de fenilo tamén é un tipo de columna de fase inversa. Este tipo de columna ten unha forte selectividade para os compostos aromáticos. Se a resposta dos compostos aromáticos medida pola columna C18 ordinaria é débil, pode considerar substituír a columna de fenilo. Por exemplo, cando estaba a facer celecoxib API, a resposta do compoñente principal medida pola columna de fenilo do mesmo fabricante e a mesma especificación (todos 5 μm * 4,6 mm * 250 mm) foi aproximadamente 7 veces a da columna C18. 3.3 Columna de fase normal
Como complemento eficaz para a columna de fase inversa, a columna de fase normal é adecuada para compostos altamente polares. Se o pico aínda é moi rápido ao eluír con máis do 90% de fase acuosa na columna de fase inversa, e mesmo preto e se solapa co pico de disolvente, pode considerar substituír a columna de fase normal. Este tipo de columna inclúe a columna hílica, a columna amino, a columna ciano, etc.
3.3.1 Columna hílica A columna hílica adoita incorporar grupos hidrófilos na cadea de alquilo unida para mellorar a resposta ás substancias polares. Este tipo de columna é adecuada para a análise de substancias de azucre. O autor utilizou este tipo de columnas ao facer o contido e as substancias relacionadas da xilosa e os seus derivados. Os isómeros dun derivado da xilosa tamén poden estar ben separados;
3.3.2 Columna de amino e columna de ciano A columna de amino e a columna de ciano refírense á introdución de modificacións amino e ciano ao final da cadea de alquilo unida, respectivamente, para mellorar a selectividade para substancias especiais: por exemplo, a columna de amino é unha boa opción para a separación de azucres, aminoácidos, bases e amidas; A columna de ciano ten unha mellor selectividade ao separar substancias similares estruturais hidroxenadas e non hidroxenadas debido á presenza de enlaces conxugados. A columna de amino e a columna de ciano moitas veces poden cambiarse entre a columna de fase normal e a columna de fase inversa, pero non se recomenda cambiar frecuentemente. 3.4 Columna quiral
A columna quiral, como o nome indica, é adecuada para a separación e análise de compostos quirais, especialmente no campo dos produtos farmacéuticos. Este tipo de columna pódese considerar cando as columnas convencionais de fase inversa e de fase normal non poden conseguir a separación dos isómeros. Por exemplo, o autor utilizou unha columna quiral de 5 μm*4,6 mm*250 mm para separar os dous isómeros da 1,2-difeniletilendiamina: (1S, 2S)-1, 2-difeniletilendiamina e (1R, 2R)-1, 2 -difeniletilendiamina, e a separación entre ambos alcanzou uns 2,0. Non obstante, as columnas quirais son máis caras que outros tipos de columnas, normalmente 1W+/peça. Se hai necesidade de tales columnas, a unidade debe facer un orzamento suficiente. 3.5 Columna de intercambio iónico
As columnas de intercambio iónico son adecuadas para a separación e análise de ións cargados, como ións, proteínas, ácidos nucleicos e algunhas substancias azucaradas. Segundo o tipo de recheo, divídense en columnas de intercambio catiónico, columnas de intercambio aniónico e columnas de intercambio catiónico forte.
As columnas de intercambio catiónico inclúen columnas a base de calcio e de hidróxeno, que son principalmente adecuadas para a análise de substancias catiónicas como os aminoácidos. Por exemplo, o autor utilizou columnas a base de calcio ao analizar o gluconato de calcio e o acetato de calcio nunha solución de lavado. Ambas as substancias tiveron respostas fortes a λ=210nm, e o grao de separación chegou a 3,0; o autor utilizou columnas a base de hidróxeno ao analizar substancias relacionadas coa glicosa. Varias substancias principais relacionadas (maltosa, maltotriosa e frutosa) tiñan unha alta sensibilidade baixo detectores diferenciais, cun límite de detección tan baixo como 0,5 ppm e un grao de separación de 2,0-2,5.
As columnas de intercambio aniónico son axeitadas principalmente para a análise de substancias aniónicas como ácidos orgánicos e ións halóxenos; As columnas fortes de intercambio catiónico teñen maior capacidade de intercambio iónico e selectividade, e son adecuadas para a separación e análise de mostras complexas.
O anterior é só unha introdución aos tipos e rangos de aplicación de varias columnas comúns de cromatografía líquida combinadas coa propia experiencia do autor. Existen outros tipos especiais de columnas cromatográficas en aplicacións reais, como columnas cromatográficas de poro grande, columnas cromatográficas de poro pequeno, columnas de cromatografía de afinidade, columnas cromatográficas multimodo, columnas de cromatografía líquida de ultra-alto rendemento (UHPLC), columnas de cromatografía de fluídos supercríticos. SFC), etc. Teñen un papel importante en diferentes ámbitos. O tipo específico de columna cromatográfica debe seleccionarse segundo a estrutura e as propiedades da mostra, os requisitos de separación e outros fins.
Hora de publicación: 14-Xun-2024