Principios e métodos de análise cuantitativa por cromatografía líquida

O mecanismo de separación da cromatografía líquida baséase na diferenza de afinidade dos compoñentes da mestura polas dúas fases.

Segundo as diferentes fases estacionarias, a cromatografía líquida divídese en cromatografía líquido-sólido, cromatografía líquido-líquido e cromatografía en fase ligada.As máis utilizadas son a cromatografía líquido-sólido con xel de sílice como recheo e a cromatografía en fase ligada con microsílice como matriz.

Segundo a forma da fase estacionaria, a cromatografía líquida pódese dividir en cromatografía en columna, cromatografía en papel e cromatografía en capa fina.Segundo a capacidade de adsorción, pódese dividir en cromatografía de adsorción, cromatografía de partición, cromatografía de intercambio iónico e cromatografía de permeación en xel.

Nos últimos anos, engadiuse un sistema de fluxo de líquido de alta presión ao sistema de cromatografía en columna líquida para facer que a fase móbil fluya rapidamente a alta presión para mellorar o efecto de separación, polo que a cromatografía líquida de alta eficiencia (tamén coñecida como alta presión) xurdiu.

PARTE
01 Principio de Análise Cuantitativa da Cromatografía Líquida

Para cuantificar en base a cualitativos, requírense substancias puras como estándares;

A cuantificación por cromatografía líquida é un método relativamente cuantitativo: é dicir, a cantidade de analito na mestura estímase a partir dunha cantidade coñecida de mostra estándar pura.

PARTE
02 Bases para a cuantificación por cromatografía líquida

A cantidade da compoñente medida (W) é proporcional ao valor de resposta (A) (altura de pico ou área de pico), W=f×A.

Factor de corrección cuantitativo (f): é a constante de proporcionalidade da fórmula de cálculo cuantitativo, e o seu significado físico é a cantidade da compoñente medida representada polo valor de resposta unitaria (área de pico).

O factor de corrección cuantitativo pódese obter a partir da cantidade coñecida de mostra estándar e do seu valor de resposta.

Mida o valor de resposta do compoñente descoñecido e a cantidade do compoñente pódese obter mediante o factor de corrección cuantitativo.

PARTE
03 Termos comúns na análise cuantitativa

Mostra (mostra): solución que contén un analito para análise cromatográfica.Dividido en mostras estándar e descoñecidas.

Estándar: produto puro cunha concentración coñecida.Mostra descoñecida (descoñecida): a mestura cuxa concentración se quere ensaiar.

Peso da mostra: o peso orixinal da mostra que se vai probar.

Dilución: o factor de dilución da mostra descoñecida.

Compoñente : o pico cromatográfico que se vai analizar cuantitativamente, é dicir, o analito cuxo contido se descoñece.

Cantidade de compoñente (cantidade): o contido (ou concentración) da substancia a ensaiar.

Integeridade: proceso computacional de medir a área do pico dun pico cromatográfico mediante un ordenador.

Curva de calibración: unha curva lineal do contido do compoñente fronte ao valor de resposta, establecida a partir dunha cantidade coñecida de substancia estándar, utilizada para determinar o contido descoñecido do analito.

PARTE
04 Análise cuantitativa da cromatografía líquida

1. Seleccione un método cromatográfico adecuado para a análise cuantitativa:

l Confirmar o pico do compoñente detectado e acadar unha resolución (R) superior a 1,5

l Determinar a consistencia (pureza) dos picos cromatográficos dos compoñentes ensaiados

l Determinar o límite de detección e de cuantificación do método;sensibilidade e rango lineal

2. Establecer unha curva de calibración con mostras patrón de diferentes concentracións

3. Comprobar a exactitude e precisión dos métodos cuantitativos

4. Utilizar o software de xestión de cromatografía correspondente para implementar a recollida de mostras, o tratamento de datos e os resultados dos informes

PARTE
05 Identificación de picos cuantitativos (cualitativos)

Identifica cualitativamente cada pico cromatográfico a cuantificar

En primeiro lugar, use a mostra estándar para determinar o tempo de retención (Rt) do pico cromatográfico a cuantificar.Comparando o tempo de retención, atopa o compoñente correspondente a cada pico cromatográfico da mostra descoñecida.O método cualitativo cromatográfico consiste en comparar o tempo de retención coa mostra estándar.O criterio Insuficienteconfirmación adicional (cualitativa)

1. Método de adición estándar

2. Use outros métodos ao mesmo tempo: outros métodos cromatográficos (cambiar o mecanismo, como: utilizar diferentes columnas cromatográficas), outros detectores (PDA: comparación de espectros, busca de bibliotecas de espectros; MS: análise de espectros de masas, busca de bibliotecas de espectros)

3. Outros instrumentos e métodos

PARTE
06 Confirmación da consistencia máxima cuantitativa

Confirmar a consistencia do pico cromatográfico (pureza)

Asegúrese de que só hai un compoñente medido baixo cada pico cromatográfico

Comprobar a interferencia de substancias coeluyentes (impurezas)

Métodos para a confirmación da consistencia cromatográfica máxima (pureza)

Comparación de espectrogramas con detectores de matriz de fotodiodos (PDA).

Identificación da pureza máxima

2996 Teoría do ángulo de pureza

Métodos cuantitativos usados ​​habitualmente na PARTE 07

Método de curva estándar, dividido en método estándar externo e método estándar interno:

1. Método estándar externo: o máis utilizado na cromatografía líquida

Preparáronse unha serie de mostras patrón de concentracións coñecidas utilizando mostras puras dos compostos que se van a ensaiar como mostras estándar.inxectado na columna ata o seu valor de resposta (área de pico).
Dentro dun determinado intervalo, hai unha boa relación lineal entre a concentración da mostra estándar e o valor de resposta, é dicir, W= f×A , e faise unha curva estándar.

Baixo exactamente as mesmas condicións experimentais, inxecta a mostra descoñecida para obter o valor de resposta do compoñente que se vai medir.Segundo o coeficiente f coñecido, pódese obter a concentración do compoñente a medir.

As vantaxes do método estándar externo:operación e cálculo sinxelos, é un método cuantitativo de uso común;sen necesidade de que cada compoñente sexa detectado e eluído;requírese unha mostra estándar;as condicións de medición da mostra estándar e da mostra descoñecida deben ser coherentes;o volume de inxección debe ser preciso.

Desvantaxes do método estándar externo:Requírese que as condicións experimentais sexan altas, como a sensibilidade do detector, o caudal e a composición da fase móbil non se poden cambiar;o volume de cada inxección debe ter boa repetibilidade.

2. Método estándar interno: preciso, pero problemático, máis utilizado nos métodos estándar

Engádese ao estándar unha cantidade coñecida do estándar interno para facer un patrón mixto e prepáranse unha serie de estándares de traballo de concentración coñecida.A relación molar do estándar ao estándar interno no patrón mixto permanece inalterada.Inxectar na columna cromatográfica e tomar (área de pico de mostra estándar/área de pico de mostra estándar interna) como valor de resposta.Segundo a relación lineal entre o valor de resposta e a concentración do patrón de traballo, é dicir, W= f×A , faise unha curva estándar.

Engádese á mostra descoñecida unha cantidade coñecida de patrón interno e inxéctase na columna para obter o valor de resposta do compoñente que se vai medir.Segundo o coeficiente f coñecido, pódese obter a concentración do compoñente a medir.

Características do método estándar interno:Durante a operación, a mostra e o patrón interno mestúranse e inxéctanse na columna cromatográfica, de xeito que, mentres a relación entre a cantidade de compoñente medida e o patrón interno na solución mesturada sexa constante, o cambio do volume da mostra. non afectará os resultados cuantitativos..O método estándar interno compensa a influencia do volume da mostra, e mesmo da fase móbil e do detector, polo que é máis preciso que o método estándar externo.

PARTE
08 Factores que afectan aos resultados da análise cuantitativa

A mala precisión pode ser causada por:

Integración incorrecta da área de pico, descomposición da mostra ou impurezas introducidas durante a preparación da mostra, frasco de mostra non selado, volatilización da mostra ou do disolvente, preparación incorrecta da mostra, problemas de inxección da mostra, preparación do estándar interno incorrecta

Posibles razóns para a mala precisión:

Integración incorrecta dos picos, problemas de inxección ou inxección, descomposición da mostra ou impurezas introducidas durante a preparación da mostra, problemas cromatográficos, resposta degradada do detector